简苟毛糙2006: 您好，我咫尺准备用ELISA法夹心法测东谈主血清中IL-1，IL-6，CRP，TNF，可是对具体操作还有些很初级的问题，请问: 1.预实际时，圭臬品的浓度如何笃定?梯度作念几个，需要作念空缺孔吗?复孔要作念吗? 2.样本的梯度作几个?稀释倍数笃定的依据时什么? 3.我测的样本中TNF量很低，海外有东谈主用高敏试剂盒，国内灵验化学发光法，您知谈有莫得更经济的门径? 多谢!请问简苟毛糙2006：双抗夹心法中，终末TMB用硫酸拆开，测量OD450的本领是用单波长450nm依然双波长测量？要是是后者，参考波长是哪个？630nm不错吗？我阴性阳性血清王人是从1：50启动被比稀释，到1：25600，阳性OD值王人在1.0以上，1.7以下。阴性值在0.3以下。0.2的未几，大批在0.1偏激以下。我的血清效价这样高，可是若何OD值到不了别东谈主说的2或者3呢？简苟毛糙2006： 谢谢你的匡助 我是用波折ELISA检测东谈主补体C1q 抗体，还思讨教简苟毛糙2006 我的预实际是这样的 1、用pH9.6，0.05M的碳酸盐稀释抗原C1q，10ug/mL，5ug/mL，2.5ug/mL 100uL/孔，4渡过夜，PBST洗板三次 2、用10%的小牛血清（pH7.2的PBS），200uL/孔，37度3h，PBST洗板三次 3、加入阴阳性血清100uL/孔，37度，2h，PBST洗板五次 4、 PBST(含1%的小牛血清)稀释酶标记的羊抗东谈主IgG1:10000，1:20000， 1:40000，100uL/孔 ，37度，半小时 效力：   10ug/mL  5ug/mL  2.5ug/mL1:10000 +   0.983  0.740  0.7141:10000 -   0.577  0.676  0.5761:10000空缺 0.180  0.134  0.0971:20000 +   0.508  0.506  0.3671:20000 -   0.333  0.385  0.3131:20000空缺 0.085  0.094  0.0781:40000 +   0.331  0.379  0.2291:40000 -   0.233  0.303  0.2611:40000空缺0.061  0.068  0.06 请简苟毛糙2006维护分析，谢谢。我该若何选拔包被浓度，酶的浓度以及阻滞的条目如何，多谢简苟毛糙2006 :你好咱们咫尺的实际是从肝组织匀浆中检测TNF-a，但好几次预试的效力，TNF-a的含量王人卓著了试剂盒的上限，咱们的试剂盒是从晶好意思买的，肝匀浆的浓度从1:10 1:20 1:40 到1:100 1:200王人莫得很大的区别，匀浆用的是PBS，匀浆门径用的是先用匀浆器研碎，再在-86度雪柜反复冻融3次，其余均严格按试剂盒内评释操作，请问这可能是哪一步出了问题?或是肝匀浆本人也会导致假阳性效力?如何才气处分?谢谢了，在线等!简苟毛糙2006 :你好能不可说少量点对于保护液的配方。最近忙了些，更新较少，不好道理gsljz wrote:请问楼主：我思我方作念某个抗原成份的elisa试剂，即我方包被酶标板，莫得抗原作念圭臬品若何办？是否需要去买？作念ELISA试剂一定要有圭臬品，莫得的话就无法评价这个试剂的猛烈。你的抗原身分是从什么开头的？思观念我方作念少量不错吗？shunshun wrote:简苟毛糙2006: 您好，我咫尺准备用ELISA法夹心法测东谈主血清中IL-1，IL-6，CRP，TNF，可是对具体操作还有些很初级的问题，请问: 1.预实际时，圭臬品的浓度如何笃定?梯度作念几个，需要作念空缺孔吗?复孔要作念吗? 2.样本的梯度作几个?稀释倍数笃定的依据时什么? 3.我测的样本中TNF量很低，海外有东谈主用高敏试剂盒，国内灵验化学发光法，您知谈有莫得更经济的门径? 多谢!圭臬品最好是买国度圭臬品然后我方稀释，要是莫得，不错我方稀释了以后找一些国际公认的定量试剂盒来定标。圭臬品最好作念复孔，衰败在锤真金不怕火初期，要是你的显色剂很安祥的话，空缺孔可作念可不作。在我方锤真金不怕火时圭臬品浓度不错无用太多，三个（高中低）即可。你样本中TNF的量低到什么进程，一般好的ELISA不错测到ng级别，再小的话就不行了。化学发光法以及相比经济了，你还不错试试生物素亲和素放大的酶免法，不错擢升好多聪敏度的。kcid wrote:请问简苟毛糙2006：双抗夹心法中，终末TMB用硫酸拆开，测量OD450的本领是用单波长450nm依然双波长测量？要是是后者，参考波长是哪个？630nm不错吗？要是有条目的话，就用双波长 450【BOIN-112】巨乳・爆乳 正常位の乳揺れ 2，630要是莫得【BOIN-112】巨乳・爆乳 正常位の乳揺れ 2，单波长也不错crystal2006 wrote:我阴性阳性血清王人是从1：50启动被比稀释，到1：25600，阳性OD值王人在1.0以上，1.7以下。阴性值在0.3以下。0.2的未几，大批在0.1偏激以下。我的血清效价这样高，可是若何OD值到不了别东谈主说的2或者3呢？要是你的1：50 OD是1.7， 到了1：25600，OD还有1.0以上的话，这个效力或者你的系统有问题，你是用什么稀释的，稀释液的OD是若干？coloursofwind wrote:简苟毛糙2006： 谢谢你的匡助 我是用波折ELISA检测东谈主补体C1q 抗体，还思讨教简苟毛糙2006 我的预实际是这样的 1、用pH9.6，0.05M的碳酸盐稀释抗原C1q，10ug/mL，5ug/mL，2.5ug/mL 100uL/孔，4渡过夜，PBST洗板三次 2、用10%的小牛血清（pH7.2的PBS），200uL/孔，37度3h，PBST洗板三次 3、加入阴阳性血清100uL/孔，37度，2h，PBST洗板五次 4、 PBST(含1%的小牛血清)稀释酶标记的羊抗东谈主IgG1:10000，1:20000， 1:40000，100uL/孔 ，37度，半小时 效力： 10ug/mL 5ug/mL 2.5ug/mL1:10000 + 0.983 0.740 0.7141:10000 - 0.577 0.676 0.5761:10000空缺 0.180 0.134 0.0971:20000 + 0.508 0.506 0.3671:20000 - 0.333 0.385 0.3131:20000空缺 0.085 0.094 0.0781:40000 + 0.331 0.379 0.2291:40000 - 0.233 0.303 0.2611:40000空缺0.061 0.068 0.06 请简苟毛糙2006维护分析，谢谢。我该若何选拔包被浓度，酶的浓度以及阻滞的条目如何，多谢1）在包被进程和阻滞以后，洗1次就不错了2）你这个效力评释你的酶标抗体和包被的响应板有一些非特异性吸附，淡薄你将阻滞换成1％的BSA或者5％的脱脂奶粉，在酶标抗体的稀释液中将小牛血清的浓度加多到20％。3）波折法的话，血清需要稀释，你的阴性、阳性血清稀释了吗，要是莫得的话，淡薄1：10到1：100，不同的稀释度你试试。要是你正本莫得，要稀释后再作念的话，字据你咫尺的效力，意想你要擢升包被浓度或者酶标抗体浓度。yangji wrote:简苟毛糙2006 :你好咱们咫尺的实际是从肝组织匀浆中检测TNF-a，但好几次预试的效力，TNF-a的含量王人卓著了试剂盒的上限，咱们的试剂盒是从晶好意思买的，肝匀浆的浓度从1:10 1:20 1:40 到1:100 1:200王人莫得很大的区别，匀浆用的是PBS，匀浆门径用的是先用匀浆器研碎，再在-86度雪柜反复冻融3次，其余均严格按试剂盒内评释操作，请问这可能是哪一步出了问题?或是肝匀浆本人也会导致假阳性效力?如何才气处分?谢谢了，在线等!这个我莫得作念过，不知谈肝匀浆本人是否会导致假阳性效力，你不错碰行运用1：200匀浆后赢得的匀浆液再用PBS稀释，稀释的比例大一些，再用试剂盒测一下，会有什么效力？天天知谈 wrote:简苟毛糙2006 :你好能不可说少量点对于保护液的配方。这个相比不便捷特别感谢！简苟毛糙2006 :你好，向您讨教几个我一直王人莫得弄显着的几个问题，谢谢！1、我看见有的夹心ELISA试剂盒中检测抗体和拿获抗体为一种抗体，而不是诀别针对待测抗原的不同表位的一双抗体。我不睬解的方位是：拿获抗体把抗原上的表位王人集合结束，检测抗体若何能与抗原集合呢？2、在网上不错搜索到关联夹心ELISA检测TNF、CEA、IL－2、IL－8等评释书（王人是开头于第四军医大学的居品），我发现它们所用的稀释液配方王人不一样，别离很大。TNF-a的稀释液：PBS 100ml；BSA(牛血皎皎卵白) 0.1g。IL-6的稀释液：洗涤液 100ml ; BSA(牛血皎皎卵白) 0.1g。IL-8的稀释液：洗涤液 100 ml；PEG(聚乙二醇，MW6000) 3.0g。我思知谈是字据什么原则来选拔稀释液的构成？有莫得不错通用的啊？谢谢！简苟毛糙2006，你好！我是干临床的，对实际不熟练，有几个苟简的问题思讨教一下：要测血清VEGF水平，采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法，试剂盒是96孔的，我要八成测50～60个患者，蚁集病例需要本领，请问血清最长不错在雪柜里放弃多长本领？另外分若干次作念相比稳当？谢谢！我用PBST加了1%BSA当作稀释液。稀释液的OD值莫得测过，可是用相似的稀释液作其他的样品就不是这样貌的。八月桂花 wrote:简苟毛糙2006 :你好，向您讨教几个我一直王人莫得弄显着的几个问题，谢谢！1、我看见有的夹心ELISA试剂盒中检测抗体和拿获抗体为一种抗体，而不是诀别针对待测抗原的不同表位的一双抗体。我不睬解的方位是：拿获抗体把抗原上的表位王人集合结束，检测抗体若何能与抗原集合呢？2、在网上不错搜索到关联夹心ELISA检测TNF、CEA、IL－2、IL－8等评释书（王人是开头于第四军医大学的居品），我发现它们所用的稀释液配方王人不一样，别离很大。TNF-a的稀释液：PBS 100ml；BSA(牛血皎皎卵白) 0.1g。IL-6的稀释液：洗涤液 100ml ; BSA(牛血皎皎卵白) 0.1g。IL-8的稀释液：洗涤液 100 ml；PEG(聚乙二醇，MW6000) 3.0g。我思知谈是字据什么原则来选拔稀释液的构成？有莫得不错通用的啊？谢谢！1)畴昔情况下，双抗体夹心法中使用的包被抗体和酶标记抗体折服不是团结个抗体，要是是团结个的话，会有很强的竞争，应该是无法作念的。你是若何知谈别东谈主试剂盒中使用的是团结个抗体的呢，这应该是无法了解的呀？2）稀释液基本上是和所使用的原料关联，不同的原料构成的检测疏通物资的试剂盒所使用的稀释液就可能不同。从你提供的数据看，IL-6的稀释液应该只比TNF-a多了个Tween－20费力，别离不是很大。至于选BSA依然PEG那就和原料有很大关系了omphalos wrote:简苟毛糙2006，你好！我是干临床的，对实际不熟练，有几个苟简的问题思讨教一下：要测血清VEGF水平，采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法，试剂盒是96孔的，我要八成测50～60个患者，蚁集病例需要本领，请问血清最长不错在雪柜里放弃多长本领？另外分若干次作念相比稳当？谢谢！这要看你测的VEGF最血清中是否安祥了crystal2006 wrote:我用PBST加了1%BSA当作稀释液。稀释液的OD值莫得测过，可是用相似的稀释液作其他的样品就不是这样貌的。你这个效力重迭过吗，有一个原则，即是你往低浓度稀释的话，OD值折服应该会下落，且要是系统工艺好的话，应该不错稀释到0.1以下的，因为低于试剂盒的聪敏度了，要是你若何稀释王人有1.0，那折服是那儿出问题了我的这个效力重迭过屡次，不是永久稀释王人降不下去，不错降下去的。我思问的即是为什么我效价这样高的血清1：50稀释的OD值王人不是2以上呢？我从来莫得作念到2.0以上的值！ 还有一个问题，即是我配TMB时是用DMSO配成10mg/ml来用，可是最近两次配TMB时，配好放到4度后老是凝起来了，嗅觉像是温度太低冻住了，不知是什么原因？简苟毛糙2006:您好 我买的CRP的试剂盒聪敏度为1.6ng/ml， 文件中我所测的样本中crp的浓度大要在0.18-7.97mg/l，而试剂盒中圭臬品的浓度是配好的，诀别为:10，30，100，250，500ng/ml，这样我预锤真金不怕火时圭臬品应该如何选拔呢，作念几个梯度呢?样本我思用原浓度，还需要再作念稀释吗? 相似的IL-6试剂盒聪敏度为2pg/ml，而文件中浓度领域在0.92-2.85pg/ml， 试剂盒推选圭臬品的浓度为:250pg/ml，125， 62.5， 31.5， 15.625， 7.8pg/ml，预锤真金不怕火应该如何选拔圭臬品和样本的呢?简苟毛糙2006:您好咱们实际室有作念 Western用的一抗和二抗，请问不错用来作念ELISA吗？（一抗是鼠单抗，二抗羊抗鼠抗体－HRP）要领：1、卵白包被到板上； 2、一抗孵育 3、二抗孵育 4、显色请问不错这样作念吗？简苟毛糙2006:您好!我前段本领作念了ELISA，测的是小鼠星形胶质细胞培养上清液内NGF和BDNF的值，参考海外文件用ELISA是不错测的。我买的是好意思国MARKET公司的用于测小鼠血清的制品试剂盒，是双抗夹心法。我按居月旦释书上的门径要领作念了两遍，效力王人差未几。所测样本的OD值王人类似于圭臬品为0 pg/ml孔的值。我所测的圭臬品的值与评释书上提供的还相比接近，且近成直线。我所蚁集的样本亦然参考海外文件用的是无血清培养基培养两天后蚁集的是我的样本的问题依然试剂盒 的问题？依然我的实际门径？。让东谈主沉闷，请赐教一二。crystal2006 wrote:我的这个效力重迭过屡次，不是永久稀释王人降不下去，不错降下去的。我思问的即是为什么我效价这样高的血清1：50稀释的OD值王人不是2以上呢？我从来莫得作念到2.0以上的值！ 还有一个问题，即是我配TMB时是用DMSO配成10mg/ml来用，可是最近两次配TMB时，配好放到4度后老是凝起来了，嗅觉像是温度太低冻住了，不知是什么原因？要是一直王人够不上2.0以上的效力，可能和你的原料关联。shunshun wrote:简苟毛糙2006:您好 我买的CRP的试剂盒聪敏度为1.6ng/ml， 文件中我所测的样本中crp的浓度大要在0.18-7.97mg/l，而试剂盒中圭臬品的浓度是配好的，诀别为:10，30，100，250，500ng/ml，这样我预锤真金不怕火时圭臬品应该如何选拔呢，作念几个梯度呢?样本我思用原浓度，还需要再作念稀释吗? 相似的IL-6试剂盒聪敏度为2pg/ml，而文件中浓度领域在0.92-2.85pg/ml， 试剂盒推选圭臬品的浓度为:250pg/ml，125， 62.5， 31.5， 15.625， 7.8pg/ml，预锤真金不怕火应该如何选拔圭臬品和样本的呢?0.18-7.97mg/l尽头于0.18-7.97ug/ml，作念定量锤真金不怕火的本领圭臬品王人是要作念的，这样才气够赢得准确的效力，你要意想一下样品的浓度稀释到100－250ng/ml把握，要是意想不出，就按你的领域的高下限诀别稀释到八成这个浓度。 相似的IL-6试剂盒聪敏度为2pg/ml，而你的标本浓度在0.92-2.85pg/ml，这评释你的这个试剂盒不太能餍足你这个标本的检测需要，聪敏度偏低，你可能需要更聪敏的试剂盒才气赢得准确的效力healthlee wrote:简苟毛糙2006:您好咱们实际室有作念 Western用的一抗和二抗，请问不错用来作念ELISA吗？（一抗是鼠单抗，二抗羊抗鼠抗体－HRP）要领：1、卵白包被到板上； 2、一抗孵育 3、二抗孵育 4、显色请问不错这样作念吗？一抗包被，卵白是被测物，加入二抗（酶标记抗体）即双抗体夹心法，你不错望望筹办贵府yjwjxxw wrote:简苟毛糙2006:您好!我前段本领作念了ELISA，测的是小鼠星形胶质细胞培养上清液内NGF和BDNF的值，参考海外文件用ELISA是不错测的。我买的是好意思国MARKET公司的用于测小鼠血清的制品试剂盒，是双抗夹心法。我按居月旦释书上的门径要领作念了两遍，效力王人差未几。所测样本的OD值王人类似于圭臬品为0 pg/ml孔的值。我所测的圭臬品的值与评释书上提供的还相比接近，且近成直线。我所蚁集的样本亦然参考海外文件用的是无血清培养基培养两天后蚁集的是我的样本的问题依然试剂盒 的问题？依然我的实际门径？。让东谈主沉闷，请赐教一二。要是你有其它圭臬品的话，就不错考证一下试剂盒是否准确。在莫得其它任何标本的情况下，而试剂盒又相比可靠的话，我只可说你的标本可能有问题。还要讨教您一个问题，我测IL-1.IL-6，TNF，CRP细胞因子，用血浆和血清哪个更好？要是必须用血浆用什么抗凝剂影响小？ 特别感谢简苟毛糙2006 作念过多肽包被吗，有什么样的心得思交流一下简苟毛糙2006 您好，我正在作念一个检测风湿病主义的试剂盒，用的是波折法。但作念下来老嗅觉阴性值偏高，大部分为0.1~0.2，也有大于0.2的。通过拉大血清和酶标抗体的稀释度，不错把阴性值降下去，但阳性值也随着降。我咫尺思通过一种观念，拉大阴阳性的差距，同期裁减阴性值，望赐教！我的实际标准如下：（1）用包被液（CBS）稀释包被抗原，10μg/ml。（2）将加有抗原的包被液加入各孔，100μl/孔。（3）4℃ 16-18h.（4）甩去包被液，洗板三次，拍干，加入PBST+1%BSA阻滞液，200μl/孔。（5）室温阻滞1h。 弃去阻滞液，洗板三次，拍干。（7）将包被板条真空抽干并于真空箱内保存1h。检测标准：1.标本室温温育30分钟，洗涤3次。2.加酶标抗体室温温育30分钟，洗涤5次。3.加显色液，室温温育30分钟，拆开读数。血清稀释液配方：PBST+1%BSA酶标抗体稀释液配方为购买谢谢！shunshun wrote:还要讨教您一个问题，我测IL-1.IL-6，TNF，CRP细胞因子，用血浆和血清哪个更好？要是必须用血浆用什么抗凝剂影响小？ 特别感谢这个我莫得作念过，去查一些贵府，应该会有评释的weiguolan wrote:简苟毛糙2006 您好，我正在作念一个检测风湿病主义的试剂盒，用的是波折法。但作念下来老嗅觉阴性值偏高，大部分为0.1~0.2，也有大于0.2的。通过拉大血清和酶标抗体的稀释度，不错把阴性值降下去，但阳性值也随着降。我咫尺思通过一种观念，拉大阴阳性的差距，同期裁减阴性值，望赐教！我的实际标准如下：（1）用包被液（CBS）稀释包被抗原，10μg/ml。（2）将加有抗原的包被液加入各孔，100μl/孔。（3）4℃ 16-18h.（4）甩去包被液，洗板三次，拍干，加入PBST+1%BSA阻滞液，200μl/孔。（5）室温阻滞1h。 弃去阻滞液，洗板三次，拍干。（7）将包被板条真空抽干并于真空箱内保存1h。检测标准：1.标本室温温育30分钟，洗涤3次。2.加酶标抗体室温温育30分钟，洗涤5次。3.加显色液，室温温育30分钟，拆开读数。血清稀释液配方：PBST+1%BSA酶标抗体稀释液配方为购买谢谢！用CB包被，不加NaCl，在板制备进程中洗涤只用1次即可。血清稀释浓度休养莫得道理，必定是同升同降，你应该试试将包被浓度和酶标抗体浓度作念方阵滴定望望，不一定10ug/ml是最好包被浓度我昨天第一次作念ELISA，评释书说５分钟内测ＯＤ值，我那时调仪器，八成２０多分钟后测的，对效力影响大吗？会升高依然裁减？先谢谢了！鑫系列第一季